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无菌采集病死鹿的肝脏、脾脏、肠系膜淋巴结病料,划线接种于厌氧培养基、鲜血营养琼脂平板和S.S.平板,7℃培养 h观察结果。在鲜血琼脂上分离到一株革兰氏阳性大杆菌,形成圆形、表面光滑隆起、边缘整齐、浅灰色菌落,周围呈β溶血环。在厌氧肉肝汤中扩菌培养,结果分离到兼性厌氧的革兰氏阳性杆菌。有荚膜,有芽孢,在肾脏样品中分离到双球菌样,短小革兰氏阳性球杆菌。接种于厌氧肉肝汤培养基培养。7℃培养, h观察结果,呈圆形、球状凸起、半透明,表面光滑。菌落周围呈β溶血环。
. 直接涂片镜检 在肝、脾、肾和肠涂片上发现大量革兰氏阳性大杆菌,有荚膜,放置数小时后可观察到芽孢。
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. 毒素检查及中和试验 取病鹿肠内容物加 倍生理盐水稀释,经离心 000 r/min,取上清液,滤过除菌分成两份,一份加热(00℃ min),一份不加热,注射小鼠尾静脉(0.ml),天后不加热组小鼠死亡,证明有毒素存在。另将滤液分成份分别加入A、B、C、D型魏氏梭菌抗毒素血清及生理盐水(对照),混合均匀后,在7℃下作用0 min,然后各静脉注射只小鼠,观察 h,记录实验结果。根据死亡及存活的情况,判定为A型魏氏梭菌。
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. 动物回归实验 将分离到的菌株取其厌氧培养液体0. ml肌肉注射豚鼠只8 h内全部死亡。对照组豚鼠只,每只注射0. ml生理盐水,于 h、8 h、7 h观察结果,对照组豚鼠健康存活。对死亡的豚鼠进行剖检,注射部位有大量带血气泡样的水肿液,取其肝、脾做涂片,革兰氏染色观察呈革兰氏阳性大杆菌,有荚膜,形态与注射的菌株相同。
. 生化试验 取分离到的菌作为Ⅰ号菌与Ⅱ号菌作生化试验。结果见表。
表 生化实验结果(略) 特种养殖网
根据结果显示,可确定Ⅰ号菌为产气荚膜梭菌。Ⅱ号菌为肾型棒状杆菌。产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)又称魏氏梭菌,是引起各种动物坏死性肠炎、肠毒血症和人创伤性气性坏疽的主要病原之一。该菌分为A、B、C、D和E等型,其致病因子是菌体产生的毒素。其中α和β毒素是A型产气荚膜梭菌产生的一种坏死性和致死性毒素。